Неорганическая
Органическая
Коллоидная
Биологическая
Биохимия
Токсикологическая
Экологическая
Химическая энциклопедия
Советская энциклопедия
Справочник по веществам
Гетероциклы
Теплотехника
Углеводы
Квантовая химия
Моделирование ХТС
Номенклатура
Таблица Менделеева
Неорганические реакции
Органические реакции
Молярные массы
Форматирование формул
Редактор формул
Уравнивание реакций
Электронное строение атомов
Игра «Таблица Менделеева»
Термодинамические свойства
Конвертер величин
Гальванопара
Форум
Лекарства
Фармацевтика
Термины биохимии
Коды загрязняющих веществ
Стандартизация
Каталог предприятий


Масс-спектрометрия

Итак, имеется моносахарид или его метилированное производное. Установить строение – значит решить две группы задач. Прежде всего надо выяснить длину углеродной цепи, природу, число и расположение функциональных групп; для метилированных сахаров, в частности,- число и положение метильных групп. Все это в совокупности иногда называют бутлеровской структурой. Затем нужно установить конфигурацию ассиметрических центров, т.е. решить задачу того же типа, которую решал Эмиль Фишер для глюкозы, маннозы и арабинозы. В этой главе мы рассмотрим пути решения задач первой группы одним наиболее общим и употребительным в современной науке методом – с помощью осколочной масс-спектрометрии.

Принципиально масс-спектрометр состоит из четырех блоков: системы напуска, ионного источника, системы магнитной фокусировки и детектора (рис. 1). В системе напуска образец анализируемого вещества испаряют в вакууме. Образовавшиеся пары поступают в ионный источник, где подвергаются бомбардировке пучком ускоренных электронов (энергия обычно порядка десятков электронвольт). Энергия облучения расходуется на выбивание электронов из молекул анализируемого вещества – последние превращаются в положительно заряженные ион-радикалы. Такие частицы высоко реакционноспособны и нестойки. Тут же в ионизационной камеры они претерпевают распад на заряженные и незаряженные осколки (отсюда название метода «осколочная масс-спектрометрия»). Вся ионизационная камера находится под высоким положительным


потенциалом по отношению к остальным частям прибора. Поэтому электростатическое поле выталкивает из камеры положительные ионы. Перед выходом из камеры пучок ионов проходит через систему электростатических линз и диафрагм, так что в результате из камеры выходит узкий сфокусированный ионный луч, в котором скорости ионов зависят от их масс и зарядов.

Ионные пучок далее попадает в зону магнитной фокусировки. Здесь в магнитном поле прямолинейные траектории ионов искривляются, причем геометрия магнитного поля рассчитана так, чтобы сфокусировать ионы на детекторе. В конечном итоге ионы подходят к детектору по индивидуальным траекториям, которые целиком определяются величиной отношения массы иона к его заряду (m/e). Варьируя электростатическое или магнитное поле, можно сфокусировать на детекторе ионные потоки для каждого значения m/e и измерить количественно соответствующий таким частицам ионный ток, т.е. величину, пропорциональную числу частиц с данным m/e в анализируемой плазме. Развертка по m/e дает масс-спектр, в котором по оси абсцисс отложены величины m/e, а по оси ординат – интенсивности ионного тока, или, что то же самое, доля частиц с данным m/e в плазме (рис. 2). Поскольку в подавляющем большинстве случаев образующиеся осколки однозарядны, шкала m/e практически совпадает со шкалой ионных масс.

В описанных условиях масс-спектрометрия (а они самые обычные, но далеко не единственные) органические


вещества дают сложные масс-спектры. В них, однако, удается выделить наиболее характерные и наиболее интенсивные пики, отвечающие главным путям распада изучаемого соединения. Поскольку типичные пути распада многих классов органических соединений, в частности моносахаридов, сейчас подробно изучены, по картине масс-спектра можно составить достаточно полное представление о структуре изучаемого соединения, затратив на это минимум вещества (меньше миллиграмма, нередко лишь микрограммы) и минимум времени (на съемку спектра на хороших приборах требуются считанные минуты; иное дело, что расшифровка спектра может занять несравненно больше времени).

Как же расшифровывают масс-спектры? «Читают» спектр обычно справа налево – от больших масс к малым. И это не прихоть: крупные осколки обычно наиболее информативны. Для них возможно лишь весьма ограниченное число путей образования, тогда как «мелочь» может возникать самыми разными путями и из нее извлечь аналитически полезную информацию гораздо труднее.

Первый пик в спектре – пик молекулярного иона, т.е. ионизированной, но не распавшейся исходной молекулы. При описании спектра его обозначают буквой М. Уже из этого пика можно извлечь много полезных сведений. В самом деле, молекулярные массы – это не температуры плавления или удельные вращения. Они могут иметь только дискретные значения, подчиняющиеся вполне определенным закономерностям. Ну, например, таким простейшим, как то, что любое соединение состава C n H m O p может иметь только четную молекулярную массу. Значение молекулярной массы сразу резко ограничивает число возможных структур, а более подробный анализ спектра в области пика молекулярного иона позволяет получить еще целый ряд дополнительных данных. Мы здесь не будем разбирать этот аспект, а укажем лишь на один характериный пример. Природный бром состоит из двух изотопов 79 Br и 81 Br в соотношении 1:1. Поэтому молекулярный ион любого соединения, содержащего один атом брома, дает в масс спектре два пика равной интенсивности, различающиеся на две единицы массы. Такой дуплет в спектре весьма характерен и сразу указывает на наличие в анализируемом соединении одного атома брома. А если бы в нем было два атома брома, то соответствующие ионы дали бы пик в виде триплета с расстоянием между компонентами в две единицы массы и соотношением интенсивностей 1:2:1.

Дальше по спектру идут пики осколков. Молекулярный ион распадается на две частицы: заряженную и нейтральную. Последняя часто оказывается высокоустойчивой малой молекулой типа H 2 O, CO и т.п. Эти фрагменты нейтральны, однако их можно идентифицировать косвенно – по разности масс молекулярного иона и заряженного осколка. Поэтому последние часто описывают в разностном выражении, например:M-H 2 O, или M-18; M-CO, или M-28; M-CH 3, или M-15; M-H 2 C=C=O, или М-42 и т.д. Состав таких больших осколков обычно легко идентифицировать, так как число вариантов состава малых осколков весьма невелико. Так, например, для обычных органических соединений М-18 – это всегда M-H 2O. Таких первичных осколков, т.е. тех, которые возникают непосредственно за распадом молекулярного иона, может быть несколько, так как распад может протекать по нескольким направлениям. Первичные осколки, в свою очередь, подвергаются распаду, а продукты распада тоже распадаются. Так возникают серии ионов, отвечающих определенным путям распада, или, как чаще говорят, фрагментации молекулярного иона. Искусство расшифровки спектра в значительной мере состоит в умении из большого числа пиков выделить такие, которые увязываются в определенные серии – последовательности фрагментации исходного иона. Когда такие серии выявлены, восстановить картину распада и, следовательно, структуру анализируемого вещества уже значительно проще, особенно если исследователь опирается на общие данные о характерных путях фрагментации соединений данного класса.

Теперь, наконец, можно уже конкретно перейти к масс-спектроскопии моносахаридов. Непосредственно исследовать их этим методов затруднительно. Дело в том, что молекулы моносахаридов содержат много полярных групп, а это самым неблагоприятным образом сказывается на их летучести. Выход из положения состоит в получении подходящих более летучих производных. На их выбор накладывается целый ряд ограничений, но к настоящему времени эта трудность уже преодолена: найдено несколько классов производных, отвечающих всем требованиям, и подробно изучены закономерности их фрагментации. Чаще всего для этой цели сейчас используются ацетаты полиолов. Их получают с помощью двух весьма общих и чрезвычайно простых в экспериментальном оформлении реакций: восстановление моносахарида боргидридом натрия и последуюшего ацетилирования. Ниже эти реакции показаны на примере D-галактозы (с. 71).

Фрагментация ацетатов полиолов такого типа относительно проста. Она включает первичные ионы, образующиеся путем разрыва C-C связей углеродного скелета, а также отщепления CH 3 COO. Зная массу таких осколков и массу молекулярного иона, легко составить представление

о структуре исходного полиола и, следовательно, моносахарида. Если в молекуле имеется дезоксизвено, как например в ацетате 28, образующемся из 2-дезокси-D-рибозы (27), то характерным оказывается разрыв цепи в β -положении к дезоксизвену. Зная эту закономерность, по величине m/e соответствующих фрагментов (в данном случае m/e 159) можно установить положение дезоксизвена (см. с. 72).

Тут, однако, возникает одна неопределенность. Действительно, ацетат 29, образующийся из изомерной 4-дезоксирибозы 30, будет давать точно такой же фрагмент с m/e 159, только из нижней части молекулы. Поэтому мы еще не вправе приписать структуру исходному сахару – это может быть либо 2-дезоксипентоза, либо 4-дезоксипентоза.

Выход, однако, есть. Надо искусственно внести асимметрию в молекулу. Для этого вместо боргидрида натрия на стадии восстановления применяют его изотопный аналог – тетрадейтерийборгидрид. Тогда у углеродного атома бывшей карбонильной группы, т.е. при С-1, появляется один атом дейтерия вместо одного атома протия. В результате ацетат полиола 31 из 2-дезокси-D-рибозы дает в масс спектре тот же характеристический пик, но сдвинутый на единицу массы (разница масс дейтерия и протия), т.е. пик иона с m/e 160 вместо 159. А ион, возникающий



путем аналогичной фрагментации из изомерного соединения 32, дейтерия не содержит и, следовательно, будет по прежнему иметь m/e 159.

Для метилированных моносахаридов аналогичное превращение дает частично метилированное и частично ацетилированные полиолы. Характерное направление фрагментации таких производных – это разрыв C-C-связи около метоксильной группы. Особенно характерен такой разрыв между двумя соседними метоксильными группами (если такая пара в молекуле имеется):

По таким фрагментам можно установить положение метоксильных групп, т.е. решить главную задачу, возникающую при структурном исследовании метилированных моносахаридов. Неопределенность, возникающая здесь из-за относительно высокой их симметрии (т.е. либо 2,3-ди-О-метил-, либо 4,5-ди-О-метил-) может быть легко устранена аналогично тому, как описано выше, т.е. с применением дейтероборгидрида на стадии восстановления. Вообще надо сказать, что введение изотопной, особенно дейтериевой, метки – весьма распространенный прием в масс-спектрометрии. Вот, например, как была доказана бутлеровская структура 4-О-метил-D-глюкуроновой кислоты, полученной синтетически в виде метилового эфира 33:


Здесь из масс-спектра, точнее, всего из двух пиков ионов с m/e 262 и 191, следовала сразу вся структура – число ацетильных и метильных групп, а также тот факт, что в молекулу при восстановлении вошло три атома дейтерия, т.е. что исходное соединение было эфиром гексуроновой кислоты (один дейтерий входит при восстановлении альдегидной группы, а два – при восстановлении этерифицированного карбоксила). Кроме того, пики ионов с m/e 191 и 262 однозначно определяют положение метильной группыи и без всяких неопределенностей, так как концы были помечены дейтерием, причем по-разному: у С-1 – один атом, а у C-6 – два.

Итак, масс-спектрометрия – чрезвычайно информативный метод установления строения. Но для нее, конечно, нужно иметь индивидуальное вещество, т.е. произвести предварительное разделение смеси, в которой вещество находится.Такой результат достигается непросто (особенно при работе с метилированными сахарами) требует сложной (и в экспериментальном и в приборном отношении) хроматографической техники. Наивысшее современное достижение в этой области – объединение газо-жидкостного хроматографа и масс-спектрометра в одном приборе, т.е. анализ смеси методом, получившем название хромато-масс-спектрометрии.

В газо-жидкостном хроматографе вещество вносят в колонку – длинную узкую трубку с нелетучей жидкой фазой, нанесенной на пористый инертный твердый материал. Через колонку пропускают струю газа-носителя при определенной регулируемой температуре. Вещество в виде паров движется по колонке с током газа, непрерывно подвергаясь распределению между газовой (подвижной) и жидкой (неподвижной) фазами. Время, в течение которого данное вещество проходит колонку (так называемое время удерживания) зависит от летучести вещества и его способности абсорбироваться данной жидкой фазой. Оба свойства определяются тонкими особенностями структуры конкретного соединения, так что время удерживания весьма характерно и индивидуально для каждого вещества в конкретных условиях разделения. Поэтому, если в колонку внесена смесь веществ, то ее компоненты появляются на выходе из колонки в разное время: достигается их разделения. После выхода их колонки газовый поток попадает в детектор, регистрирующий появление вещества, а сигналы с детектора через усилительную схему поступают на самописец. В результате самописец выписывает кривые выхода вещества из колонки в зависимости от времени, т.е. рисует газо-жидкостную хроматограмму. Таким образом можно проанализировать состав весьма сложных смесей веществ.

Идея хромато-масс-спектрометрии состоит в том, что газы и пары, прошедшие колонку, вводят в ионизационную камеру масс-спектрометра, объединенного с хроматографом в единый комплекс – хромато-масс-спектрометр. В результате исследователь получает из одного анализа смеси сведения о временах удерживания ее компонентов, об их относительном содержании в смеси и, наконец, тут же получает масс-спектры каждого компонента смеси.

Такой метод анализа идеально подходит для изучения смесей метилированных сахаров, получающихся при мономерном анализе полисахаридов с помощью метода метилирования. В самом деле, хромато-масс-спектрометрия позволяет идентифицировать известные вещества со свидетелями при помощи прямого сравнения и тут же, используя масс-спектрометр, дополнительно подтверждать их структуру, а для неизвестных веществ или для тех, для которых не оказалось нужного заведомого образца,- установить строение (без конфигураций, конечно) по масс-спектру.

В настоящее время хромато-масс-спектрометрия – магистральный путь развития структурного анализа полисахаридов, позволяющий получить на нескольких миллиграммах изучаемого биополимера за считанные дни информацию, для добывания которой еще совсем недавно требовались десятки, а то и сотни граммов материала и годы труда.

Предыдущая страница | Следующая страница

СОДЕРЖАНИЕ

Еще по теме:

     © ХиМиК.ру




Реклама   Обратная связь   Дизайн